Лиофилизат — это высушенный под вакуумом порошок. Пока он сухой, пептид стабилен годами. Как только во флакон попадает вода, начинается обратный отсчёт. Поэтому восстановление — самая ответственная операция во всей лабораторной работе с пептидом: ошибку здесь уже не исправить.
Пептидная связь разрушается водой. Реакция называется гидролизом, и она идёт тем быстрее, чем выше температура и чем дольше молекула находится в растворе. Параллельно работают ещё три механизма: окисление остатков метионина и цистеина, дезамидирование аспарагина и глутамина, агрегация — слипание молекул в нерастворимые комплексы.
Лиофилизация убирает из ампулы воду и замораживает всю эту химию. Сухой порошок при −20 °C стабилен месяцами и годами. Восстановленный раствор — недели. Разница на два порядка, и она полностью в ваших руках.
Стандартных растворителя два, и выбор между ними определяется не свойствами пептида, а тем, сколько раз вы будете входить во флакон.
Водопроводная, минеральная, «очищенная» вода из магазина и физраствор для промывания носа растворителями не являются. Ни один из них не стерилен в том смысле, в каком это слово используется в лаборатории.
Формула одна: концентрация равна массе, делённой на объём. Во флаконе указана масса пептида, объём растворителя выбираете вы, и вместе они дают концентрацию.
| Во флаконе | Добавили воды | Концентрация | 0,1 мл раствора содержит |
|---|---|---|---|
| 10 мг | 1 мл | 10 мг/мл | 1 мг |
| 10 мг | 2 мл | 5 мг/мл | 0,5 мг |
| 10 мг | 5 мл | 2 мг/мл | 0,2 мг |
| 5 мг | 2 мл | 2,5 мг/мл | 0,25 мг |
| 20 мг | 2 мл | 10 мг/мл | 1 мг |
Инсулиновый шприц U-100 размечен не в миллилитрах, а в единицах: 100 единиц — это 1 мл, значит одна единица равна 0,01 мл. Разметка никак не связана с массой пептида: она измеряет только объём. При концентрации 5 мг/мл десять единиц шприца — это 0,1 мл раствора и 0,5 мг вещества, а при 10 мг/мл те же десять единиц — уже 1 мг. Один и тот же флакон при разном объёме воды даёт разную цену деления.
Чем меньше воды, тем концентрированнее раствор и тем грубее шаг отмеривания. Чем больше воды — тем точнее, но тем быстрее кончается объём флакона и тем больше раствора стоит в холодильнике. Рабочий компромисс для флакона 10 мг — 2 мл.
Посчитать свой флакон в калькуляторе
Восстановленный пептид хранят в холодильнике при 2–8 °C. Практический ориентир для большинства последовательностей — от двух до четырёх недель, дальше содержание действующего вещества начинает заметно падать. Если объём рассчитан на более долгую работу, раствор разливают на аликвоты и замораживают: повторные циклы заморозки и оттаивания разрушают пептид сильнее, чем само хранение.
Флакон в холодильнике ставят на полку, а не в дверцу. В дверце температура скачет при каждом открывании, а для пептида важны не столько градусы, сколько их постоянство. Подробный разбор — в статье о хранении.
Хранение пептидов: три разных срока годности
Хлорид натрия не содержит консерванта и не рассчитан на многократный забор. Для однократного использования он применим, для многодозового флакона нужна бактериостатическая вода.
Объём выбирает исследователь: он задаёт концентрацию. Для флакона 10 мг обычно берут 2 мл — получается 5 мг/мл и удобная цена деления шприца.
Чаще всего агрегация из-за встряхивания или температурных скачков, реже — неподходящий растворитель. Мутный раствор в работе не используют.